【细胞消化原理】胰酶消化细胞的原理是什么_生物_爵爷2454
编辑： admin 2017-15-06
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胰酶是一种蛋白酶.通过在特定位置上降解蛋白,使细胞间结合处蛋白降解,这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形,从而使细胞分开.不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样.胰酶分散细胞的活性还与其浓度、...
其他同学给出的参考思路：
胰酶分为胰蛋白酶，胰淀粉酶，胰脂肪酶；细胞膜及细胞之间粘连的主要成分由是脂蛋白及多糖；胰酶中的胰蛋白酶能使蛋白质转化为蛋白胨，胰脂肪酶则能使脂肪分解为甘油及脂肪酸，从而使细胞之间得到分离，细胞得到溶解
互助这道作业题的同学还参与了下面的作业题
题1： 【胰蛋白酶消化细胞的原理是什么?在做传代细胞培养时,有一步是用胰蛋白酶消化贴壁细胞,使之皱缩成圆形,请问这是什么原理呀?】[生物科目]
细胞外含有多种胞外蛋白,如胶原蛋白；使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来.用胰蛋白酶分解这些蛋白质后就可以使它们分开了!
题2： 【细胞消化成团怎么回事?细胞还没用胰酶消化,用PBS洗时,就有大量的细胞脱落下来,是怎么回事?】
细胞消化成团个人认为是和消化酶有关,消化酶是否保存不当（主要为温度）并且时间过长失去了消化活性（可以做酶活测定）,或者酶的浓度配的不合适,在允许范围（防止消化过度损伤细胞）内适当加大酶液量.以上是某f发表的一些浅见解.关于第二个有大量细胞脱落,我想是没有做好及时的细胞传代,细胞汇合80%（理想）就应该进行传代,因为在培养过程中,培养基积累了大量的细胞代谢产物,导致培养基的成分,PH值发生变化,继续培养下去是有害的：营养成分不足+代谢产物堆积导致贴壁细胞脱落死亡,因此即便你好没有进行传代前的消化作用,已经有部分死亡的细胞脱落下来了（LZ君应该是有定时做显微观察,染色鉴定死活)
仍旧是某F的浅见- -,望指教
题3： EDTA加入胰酶消化细胞的具体作用是什么?[生物科目]
细胞之间是通过CAM（细胞粘性分子）相连的,而很多粘性分子只有在有+2价金属离子,如Ca2+,Mg2+,的存在下才能行使这种功能.在胰酶中加EDTA的作用是熬合这些二价离子,使细胞被消化成单细胞形态
题4： 【胰酶消化细胞什么状态最好?】[生物科目]
在显微镜下看,大约一半细胞变圆,另一半开始变圆.加培养液终止消化,然后用吸管反复吹吸就可以把贴壁的细胞吹下来.
题5： 【请教胰酶使用注意及贴壁细胞的消化(补充时间:2010-01-0822:14)最近培养贴壁细胞,在做流式凋亡时出现假阳性的结果,故请教一些关于胰酶使用和贴壁细胞消化方面的问题,】[生物科目]
博凌科为生物科技-为你胰酶使用注意：1、在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染.2、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长,否则细胞铺板后生长状况会较差.贴壁细胞的消化：1、吸去培养液,用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次,以去除残余的血清2、加入少量胰酶细胞消化液,略盖过细胞即可,根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量.室温放置30秒至2分钟（不同的细胞消化时间有所不同）3、显微镜下观察,细胞明显收缩,并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来.4、此时吸除胰酶细胞消化液.加入含血清的完全细胞培养液,吹打下细胞,即可直接用于后续实验如果发现消化不足,则加入胰酶细胞消化液重新消化.如果发现细胞消化时间过长,未及吹打细胞,细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落,直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来.1000-2000g离心1分钟,沉淀细胞,尽量去除胰酶细胞消化液后,加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞,即可用于后续实验.常用的细胞消化液为胰蛋白酶（Trypsin）,EDTA等,其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解,改变细胞间的连接,使组织或细胞片分散成单个细胞,制成细胞悬液用于进一步的实验.影响消化速度的因素较多,主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 .加入胰蛋白酶-EDTA溶液,视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定）,以使充分浸润；一般消化时间约为1至3分钟,肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明、点状（出现细小空隙）时,弃去细胞消化液,或看见培养瓶壁呈白茫 状即可.并加入适量的完全培养液终止消化,吹打分散；如见大量细胞片状脱落,已消化过头,则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作.（消化过头,可造成大量 细胞从瓶壁上脱下,甚至造成细胞破碎.由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂,所以加入完全培养基可以终止反应.胰酶配置方法：1、培养液配制,方便好用,对细胞影响小,并且培养液的ph值正好适合胰蛋白酶的溶解2、生理盐水配制,要先调ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力搅拌2-3小时,调pH 7.8-8.0,过滤除菌.）3、pbs（0.1%胰酶溶液的配制：称取胰酶粉末0.1g,先用少许灭菌过的PBS调成糊状,然后补足到100ml.置室温搅拌4小时或冰箱内过 夜,过滤灭菌,分装,4℃保存备用.）; 或是hanks或是D-hanks液配制（1.称取胰蛋白酶粉末置烧杯中,先用少许D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状,然后再补足D-Hanks 平衡盐溶液,搅拌混匀,置室温4 小时或冰箱过夜,并不断搅拌振荡；2.次日,先用滤纸粗滤,再进行过滤除菌,分装入瓶中,低温冰箱保存备用,常用浓度为0.25% 或0.125%.胰蛋白酶溶液偏酸,使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右.）一般0.45微米的一次性滤器过滤除菌,至于作用效果,需要消化一次细胞感觉一下,因为不同厂家的酶不一样,有的作用温和,有的作用剧烈.4、是否需要四度放置过夜,取决于你的胰酶的纯度.过去的胰酶纯度不高,所以难以溶解,需要四度过夜.而现在的胰酶纯度都很高,就没有必要四度过夜.从理论上来说,四度放置过夜,给细菌生长的机会,尽管过滤可以出去细菌,可是出不掉其代谢产物.胰蛋白酶不溶,有絮状物的原因,考虑有：1、过期或是酶已经部分变性2、溶液ph值不对3、在没过滤之前的絮状沉淀是正常现象,因胰酶多取自动物胰腺,沉淀为组织块,过滤后即可