【植物细胞的分离】谁知道植物细胞的分离过程？_生物_熊猫0001A寂
编辑： admin 2017-15-06
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一、机械法分离叶肉细胞
[仪器与用具] 组织捣碎机一台(或研钵一套); 低速台式离心机1台; 100目尼龙纱布30cm×30cm 1块; 100ml量筒1个; 100ml烧杯2个; 200ml烧杯1个; 冰瓶1个; 离心管、吸管若干.
[试 剂] STN液(蔗糖0.4mol·L-1,Tricine 20mmol·L-1 pH 7.8,NaCl 10mmol·L-1).将137g 蔗糖、3.58g Tricine(三羟甲基甘氨酸)、0.58g NaCl溶于800ml左右水中,用NaOH溶液调至pH 7.8,加水至1000ml.STN液置0-4℃冰箱中备用.
[方 法] 1．选用山芋、大豆等植物的嫩叶50g左右,洗净,去叶脉,剪成2mm左右宽的叶条,放入捣碎机中,加入150ml左右的冷STN液,以10000转/分,快速捣碎15秒,或将10g左右叶片剪碎,放入研钵中,加入50ml冷STN液,研磨1分钟.
2．先将匀浆用100目的单层尼龙纱布过滤,将滤液用台式离心机低速(500转/min)离心30秒.去上层液,用少量STN液悬浮沉淀,悬浮液即为叶肉细胞.如果第一次离心后,沉淀中细胞碎片较多,可再悬浮离心一次.提取过程最好在4℃左右温度下进行.
3.细胞悬浮液放冰瓶中备用.
二、酶解法分离叶肉细胞
[仪器与用具] 抽真空装置1套或大针筒1套; 恒温水浴(最好用恒温振荡器)1台; 感量0.01g天平1台; 离心机1台; 100和50ml烧杯各2个; 镊子1把; 剪刀1把; 100目尼龙纱布30cm×30cm 1块; 刀片一把; 载玻片一块.[试 剂] 分离介质：糖醇0.4mol·L-1 (称7.3g山梨醇或甘露醇定溶于100ml水中),离析酶(Macerozyme R-10)3％,葡聚糖硫酸钾0.4％与聚乙烯吡咯烷酮2％,pH5.5.8,称0.3g离析酶、0.04g葡聚糖硫酸钾、0.2g聚乙烯吡咯烷酮溶于10ml 0.4mol·L-1山梨甘露醇溶液中,滴加HCl调至pH 5.5.8.悬浮介质：STN液（配法同上）.
[方 法] 1． 取蚕豆等嫩叶2g左右,用镊子撕去下表皮.不能撕表皮的可用剪刀剪,或用刀片切成2mm宽碎条.放烧杯中,加20ml分离介质,用抽真空装置或针筒真空渗入15秒,使分离介质渗入叶内.
2． 将酶解体系放入25~30℃水浴中,每隔2-3分钟振动一次,酶解30分钟左右,直至肉眼可见溶液中有较多的叶肉细胞沉淀为止.
3． 用100目尼龙纱布过滤酶解介质,将滤液500转/min离心30秒,舍去上层液,用10ml STN液悬浮沉淀,再离心一次,去上层液,沉淀中加入2mlSTN液稀释,即得到叶肉细胞悬浮液,细胞悬浮液置冰瓶中备用.
三、细胞活力的检查
[仪器与用具] 显微镜1台；氧电极测定光合放氧装置(见实验23)1套；吸管3支；5mL、1mL移液管各2支；0.1mL微量进样器；载玻片与盖玻片若干等.
[试 剂] 0.1％酚藏红花染液； 光合放氧测定介质(Tricine 50mmol L-1 pH7.6,NaHCO3 20mmol L-1,蔗糖0.4mol L-1) 称0.9gTricine、10.3g蔗糖、0.17gNaHCO3溶于80mL水中,用稀NaOH调至pH7.6,加水至100mL.[方 法] 1、 检细胞形态：叶片中叶肉细胞的大部分是栅栏细胞和海绵细胞,多数呈花生形.活的叶肉细胞中的叶绿体排列规则,分布均匀,在高倍镜下能看到细胞器在原生质体中移动.而受伤和死细胞,细胞收缩,叶绿体排列混乱,甚至解体,细胞内颗粒作无规则的布朗运动.
2、 色检查：将0.1％酚藏红花染液同细胞悬浮液混合,几分钟后镜检.死细胞被染上红色,而活细胞不被染色.
3、合放氧活性测定：在氧电极反应杯中加5份光合放氧测定介质,1份细胞悬浮液,照光,观察是否有放氧反应.
注意事项 1.不是所有植物的叶片都能用机械法分离出完整的叶肉细胞的,机械法仅适用于山芋、大豆、花生、苹果、槐树等植物叶片.分离细胞的活性还与叶龄有关,如分离具有高活性的大豆叶肉细胞,应采集倒2、倒3的嫩叶作为材料.
2.离体的叶肉细胞的活性随离体时间延长而降低.