简述单克隆抗体的制备过程-抗体制备-生物学习资料

编辑： admin 2017-19-02

1.对小鼠注射特定的抗原蛋白,使小鼠产生免疫反应；2.得到相应的B淋巴细胞；3.将小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合,再用特定的选择培养基进行筛选；4.在该培养基上,未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡,只有融合的杂种细胞才能生长（这种杂种细胞的特点是既能迅速大量繁殖又能产生专一的抗体）5.对上述杂交瘤细胞还需进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选,就可获得足量的能分泌所需抗体的细胞；6.最后,将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养,或注射到小鼠腹腔内增殖,这样,从细胞培养液或小鼠腹水中,就可以提取出大量的单克隆抗体了!

类似问题

类似问题1：制备单克隆抗体的过程[生物科目]

（一）脾细胞 1．材料 (1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠.(2)1640培养液单克隆抗体制备流程

(3)2.5％FCS－1640营养液 2．操作方法 (1)拉颈或用CO2处死小白鼠.(2)将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾.(3)把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球.(4)用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中.(5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中.(6)以2.5％FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）.(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮.(8)重复⑹、⑺步骤.(9)计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80％为合格.（二）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞.选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快,繁殖时间短.常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP2）；③P2—X—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO以653最为常用,它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane,降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（MinerolOilplasmacytoma,MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系.骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可.由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理.为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml8－氮鸟嘌呤.取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞,在室温离心（400g）10min,沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数.（三）饲养细胞在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞（Feedercell）.在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞.许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞.应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境.腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠.也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等.1．材料（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只.（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）.2．操作方法（1）拉颈处死小鼠.（2）70％酒精浸泡消毒10min.（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔.（4）用注射器将4ml11.6％蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管.（5）1000r／min离心10min.（6）取上清,以HAT选择培养液将细胞制成悬液.台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞.（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml,含2万个细胞,放入CO2培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用.如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少,则可以在细胞换液时再加入一些.

类似问题2：单克隆抗体的制备步骤[生物科目]

单克隆抗体的制备步骤：

1、抗原制备；?

2、免疫动物；

3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

4、细胞融合；

5、杂交瘤细胞的选择培养；

6、杂交瘤细胞的筛选；

7、杂交瘤细胞的克隆化；

8、单克隆抗体的检定；

9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；

10、单克隆抗体的大量制备.

类似问题3：单克隆抗体制备的基本原理与过程?有什么意义?[生物科目]

哈哈~我们刚考到这题

原理：

B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力.B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的.将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体.这种技术即称为单克隆抗体技术.

1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c小鼠.免疫的方法取决于所用抗原的性质.免疫方法同一般血清的制备,也可采用脾内直接免疫法.

2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前,骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选,防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）.骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养,融合前24h换液一次,使骨髓瘤细胞处于对数生长期.

3）细胞融合的关键:

1技术上的误差常常导致融合的失败.例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答.这必然要失败的.

2融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术.

4）阳性克隆的筛选应尽早进行.通常在融合后10天作第一次检测,过早容易出现假阳性.检测方法应灵敏、准确、而且简便快速.具体应用的方法应根据抗原的性质,以及所需单克隆抗体的功能进行选择.常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等.其中ELISA法最简便,RIA法最准确.阳性克隆的筛选应进行多次,均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增.

5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体.克隆化应尽早进行并反复筛选.这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的,有丢失染色体的倾向.反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株.克隆化的方法很多,而最常用的是有限稀释法.

（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞,然后进行单细胞培养.这种方法操作复杂,效率低,故不常用.

（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后,按每孔1个细胞接种在培养皿中,细胞增值后成为单克隆细胞系.第一次克隆化时加一定量的饲养细胞.由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化,所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成.应该注意的是,每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存,以便重复检查,避免丢失有意义的细胞.

（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度,然后与琼脂混悬.在琼脂中的细胞不能自由移动,彼此互不相混,从而达到单细胞培养的目的.但此法不如有限稀释法好.

（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞,然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞,并进行单细胞培养.

6）细胞的冻存与复苏

7）大规模单克隆抗体的制备选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,因为融合细胞随培养时间延长,发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加.抗体制备有两种方法.一是增量培养法,即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单克隆抗体.该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单克隆抗体的浓缩和纯化.最普遍采用的是小鼠腹腔接种法.选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠,先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去.通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集5～10ml的腹水,有时甚至超过40ml.该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平.此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化.

意义：

用于以下各种生命科学实验并具有医用价值

（1）沉淀反应：Precipitation reaction

（2）凝集实验：haemaglutination

（3）放射免疫学方法检测免疫复合物

（4）流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离.

（5）ELISA 等免疫学检测

（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的

亲和力 .

(7) 免疫印记（western blotting)

（8）免疫沉淀：

（9）亲和层析：分离蛋白质

（10）磁珠分离细胞

（11）临床疾病的诊断和治疗；

类似问题4：单克隆抗体制备过程中,正确的叙述是A能够产生坑体的B淋巴细胞是从人脾脏中获取的B用伊红美蓝鉴定培养基筛选出杂交瘤细胞C用带孔的筛板选出能产生单一抗体的杂交瘤细胞D该技术的原理[生物科目]

C A应该是小鼠

B伊红美蓝是用于鉴定自来水中大肠杆菌的含量

D应该是细胞核的全能性

类似问题5：单克隆抗体的制备过程要细一点的,最好有图.[生物科目]

过程